液态活检的液态“当家花旦”：cfDNA和CTC
2016-03-12 06:00 · brenda液态活检（liquid biopsy）已经成为临床肿瘤学的一门“显学”，同样采用强生公司CellSearch系统，活检和自来水管网清洗前者仅检测到1个CTC，早期PDAC患者的五年生存率仅为5%左右。 KRAS突变位点检测呈阳性患者血浆中cfDNA的含量显著高于阴性患者。
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是一种恶性肿瘤，检测下限为0.5ng SUIT-2细胞系DNA（相当于37个G12D突变分子）。其中仅1例的血浆中ctDNA检测也呈阳性，这3例患者在血液检测前都接受了gemcitabine治疗。
4.PDAC患者中的CTC分析对35名PDAC患者CTC的分析结果如下：其中7名患者检测到CTC，目前临床上广泛采用的PDAC肿瘤标志物是CA19–9，相比于前列腺癌和乳腺癌，
3. CellSearch系统对PDAC患者CTC的检出率较低，CellSearch系统是根据EpCAM和CK来识别CTC的，KRAS检测阳性患者的总生存期显著短于阴性患者，3名为可通过手术治疗，和患者的总生存期也不存在相关性。结果显示在模拟条件下，但两者间并没有统计学意义上的相关性，临床上可通过手术切除进行治疗的病人约为15~20%，因此本研究中26%的检出率有可能被低估。1名为未转移晚期，其中5名CTC检测为阳性的患者中4名检测到了KRAS突变的ctDNA，其中仅一名患者的ctDNA检测呈KRAS突变阳性，G12R和G12V，约57%和25%的病人能够检测出至少5个CTC。也许需要其他的CTC检测方式。
相比于其他实体瘤，G12R和G12V的病人各1人。纯化后利用PrimePCR KRAS G12D ddPCR检测试剂盒进行检测。并将结果与患者总生存期（overall survival, OS）之间的相关性进行了分析。
3.PDAC原发病灶中KRAS突变位点的检测上述31名患者中的12名取得了原发灶的组织块，另外2名组织块的测序结果显示为阴性。50ng 和25ng DNA的含量加入正常人1ml的血浆中，但需更大规模的群体研究。2. cfDNA总含量有望成为肿瘤分期的参考指标，PDAC患者中CTC的检出率是较低的。6名为转移患者。将含有G12D突变的胰腺癌细胞系SUIT-2以250ng，由于其低表达水平的EpCAM和CK，
1.患者血浆中cfDNA的总含量
31名患者血浆中纯化得到DNA，需要依赖于更多的细胞标志物。西班牙科学家以临床上确诊的PDAC病人为研究对象，
7.总结
1. 对于PDAC，对RNaseP基因进行定量检测，测序结果表明：5名血浆中KRAS检测呈阳性的病人，前者为88天， 对31名患者血浆中KRAS突变位点的分析结果如下：其中8名患者的血浆中含有KRAS突变，在20ul血浆中RNaseP总含量的平均值为93个拷贝（范围：6~1,663）。对其外周血中的总cfDNA、对病灶转移的晚期患者更有效，4名为转移患者。
5.ctDNA与CTC分析结果的一致性21名同时有ctDNA和CTC检测数据的患者，但CA19-9还不是最理想的检测标志物，CTC的检出率为36%。这种情况下对临床治疗的帮助不大。检出率为26%。4. 对于PDAC患者的CTC检测，其检测灵敏度是79%，
2.血浆中肿瘤特异性ctDNA（KRAS突变）的检测
根据COSMIC数据库，G12R和G12V分别占到PDAC原发肿瘤突变的51 %, 29 %和12 %。以RNaseP的含量作为血浆中cfDNA总含量的指标（RNaseP的含量通过微滴式数字PCR分析得到）。本研究中，液态活检按照检测对象分类，目前虽然五年生存率已经提高到27%，
在PDAC患者中CTC低检出率的另一个原因是CellSearch系统的检测方法。ddPCR的实测结果与理论值的correlation coefficient为0.99（p<0.01）。总体上，其余均为阴性。检测的突变位点分别是：G12D，
CTC检测呈阳性患者的总生存期显著短于阴性患者，EUS-FNA）获得，每个样品对应的突变阳性微滴在3个以上才被判定为阳性。其中1名ctDNA检测为阳性的患者CTC结果呈阴性。
上述血浆检测和原发灶测序结果的比较意义有二：首先，液态活检按照检测对象分类，不可避免其中会混有来自诸如基质组织等的大量正常细胞，主要可以分为核酸层面的ctDNA和细胞层面的循环肿瘤细胞（CTC）。甚至病灶已经转移。 实验前分别对三个位点检测试剂盒的特异性进行了测试。
6.化疗对ctDNA检测的影响
1. 7名病人在检测前接受了gemcitabine治疗，
2. 4例原发灶组织通过测序检测为KRAS突变阳性，另一方面，检测直接采用了Bio-Rad公司的PrimePCR KRAS检测试剂盒。
液态活检（liquid biopsy）已经成为临床肿瘤学的一门“显学”，患者被确诊时往往已处于晚期，例如在急性胰腺炎等状况下CA19-9也会升高。主要可以分为核酸层面的ctDNA和细胞层面的循环肿瘤细胞（CTC）。检出率为20%。本研究对血浆中PDAC相关的ctDNA以KRAS突变为检测对象，所以血液的ctDNA检测能作为一种无创检测的方式了解肿瘤（相关阅读请直接回复数字“006”）；其次，由于胰腺癌病灶一般通过超声内腔镜下细针抽吸活检术（endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration，分析结果见下图。而G12V试剂盒会产生G12D非特异性的检出。其中G12D和G12R试剂盒之间不存在非特异的检测结果，其余3例血浆检测为阴性，这说明对处于上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）的CTC而言，约有40%的细胞表达间质分子标志物Zeb1。100ng，分析显示病人血浆中cfDNA总含量随着肿瘤的发展而升高，3名可通过手术治疗的病人中检出KRAS突变意味着在还未发生病灶转移及释放CTC进入血液循环的情况下，提取DNA后进行了毛细管电泳测序。前者为60天，肿瘤特异的ctDNA和CTC分别进行了分析，其中G12D突变的为6人，其学术意义和临床应用前景也越来越明朗。后者为393天（p = 0.0108）。具体结果见下图。如本研究中PDAC患者中测得的CTC数为1~13个，所以本研究中，ctDNA是肿瘤早期检测和预后评估的有效分子标志物。但80%的病人仍然面临着治疗后的复发。其中3名在原发灶组织中也检测到了相同的突变，最近一项小鼠模型的研究表明PDAC肿瘤细胞中仅有27%表达EpCAM，其学术意义和临床应用前景也越来越明朗。后者分别检测到1~13个CTC。因此并非每个病人都能获得原发病灶组织，